González Gómez, Ruth
Jiménez Schuhmacher, Alberto (dir.)
Universidad de Zaragoza,
2022
Resumen: El cáncer de páncreas ocupa el puesto 12 en la incidencia de distintos tipos de cáncer globalmente, pero constituye la 7ª causa de muertes por cáncer1. La incidencia y mortalidad del cáncer de páncreas está relacionada con el envejecimiento, el tabaco y el consumo de alcohol, la diabetes y la obesidad2. Ha habido avances en el conocimiento de factores de riesgos y en biomarcadores, pero sigue existiendo la necesidad de mejora de las técnicas diagnósticas. El adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC) es un tumor altamente maligno caracterizado por una rápida progresión local y con gran potencial para metastatizar. Además, el diagnóstico normalmente se produce en estadios avanzados de la enfermedad, y las células tumorales son resistentes a los tratamientos actuales, todo esto hace que el PDAC represente uno de los cánceres con la más baja probabilidad de supervivencia3. El tratamiento estándar (SOC) para tumores avanzados de PDAC consiste en la combinación de gemcitabina y abraxane. La efectividad de la gemcitabina no resultó suficiente en su traslado a ensayos clínicos, probablemente debido a la poca penetración en el tumor debido a la baja vascularización y el denso estroma del tumor. Además, tras semanas de tratamiento los tumores de los pacientes desarrollan resistencia a gemcitabina4. La combinación de gemcitabina con otros agentes como abraxane mejora el tratamiento de pacientes de PDAC, aun así, las células tumores se vuelven resistentes y aparecen recidivas a lo largo del tiempo5.
Los transportadores ATP-binding cassete (ABC) constituyen una de las familias más amplias de proteínas transmembrana, están implicados en el movimiento de diferentes xenobióticos, compuestos, lípidos y productos metabólicos entre el citoplasma y el espacio extracelular6. Especialmente, la subfamilia ABCC, también conocida como proteína de resistencia a compuestos (MRP), aborda el mayor número de proteínas implicadas en el transporte de compuestos. Los transportadores ABC, y más específicamente las proteínas MRP, se han encontrado sobreexpresados en diversos tipos de cáncer, y han sido propuestos como biomarcadores de los mismos7. Incluso, estos transportadores han sido relacionados con la resistencia a agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de pacientes de PDAC8. ABCC3 ha sido recientemente mostrado como una de las proteínas sobreexpresadas en PDAC, y ha sido relacionada con un incremento de la proliferación de células y tumores9. Nuestros estudios han consistido en profundizar en las funciones de ABCC3 en PDAC con un posible transportador de gemcitabina y su posible relación con la capacidad stemness de este tipo de cáncer.
Nuestra hipótesis era que ABCC3 está sobreexpresado en tumores PDAC y confiere resistencia a tratamientos con gemcitabina. Nuestro primer objetivo fue determinar la implicación de ABCC3 en proliferación y resistencia en PDAC. Corroboramos que la falta de ABCC3 reduce la proliferación in vitro e in vivo y que es uno de los responsables de la resistencia a gemcitabina en PDAC.
Uno de los principales retos en el abordaje del tratamiento de PDAC es la resistencia de las ¿cancer stem cells¿ (CSCs). Estas células constituyen una subpoblación de células con características de auto-regeneración, diferenciación, y habilidades que participan en el inicio, la progresión y la metástasis de tumores10. Las CSCs han sido caracterizadas por la expresión de proteínas que favorecen sus habilidades especiales, como la aldehído deshidrogenasa (ALDH) o los transportadores ABC, que contribuyen a su capacidad de auto-regeneración y quimioresistencia11.
ABCC3 se ha relacionado con ¿stemness¿ en otros tipos de cáncer, como cerebro o mama12,13. Una vez que demostramos la implicación de ABCC3 en quimioresistencia, quisimos investigar la relación del transportador ABCC3 y ¿stemness¿ en PDAC. Pudimos observar que las CSCs son la subpoblación que expresa ABCC3, y que esto podría estar relacionado, en parte, con su capacidad para ser resistentes a agentes quimioterapéuticos.
Las CSCs de PDAC se caracterizan por favorecer el metabolismo mitocondrial en lugar del glicolítico. Estas metabolismo oxidativo conlleva un incremento de las enzimas relacionadas con este metabolismo, y un incremento de niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS)14. El glutatión (GSH) es un conocido antioxidante en las células, y se ha descrito como sustrato de diferentes transportadores ABC, incluido ABCC315. Nuestra hipótesis fue que las CSCs podrían regular los niveles de ROS mediante la participación de ABCC3 en el transporte intracelular de GSH para mantener un equilibrio y evitar los altos niveles de ROS. Corroboramos que las CSCs utilizan la fosforilación oxidativa (OXPHOS) como la principal ruta de obtención de adenosín trifosfato (ATP). Es más, pudimos observar que ABCC3 es uno de los transportadores de GSH y que está implicado en rutas antioxidantes.
Los anticuerpos y fragmentos derivados de anticuerpos han sido utilizados para su uso en diagnóstico y terapia en diferentes enfermedades. Los nanoanticuerpos (Nbs) son derivados de la región de unión a antígeno de anticuerpos de cadena pesada (HcAbs) presentes en camélidos. Los Nbs conserva el potencial de unión a antígenos pero presentan un tamaño menor (12-15 kDa), lo que reduce su tiempo de vida medio en el torrente sanguíneo (0.5-1 h)16.
La inmuno-tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imagen que combina la especificidad de los Abs o fragmentos derivados de Abs con la selectividad del PET. Es una novedosa opción para mejorar el diagnóstico por imagen para una detección concisa y la cuantificación de la diana17. Nuestro segundo objetivo fue generar Nbs que reconocen ABCC3 para su uso en técnicas rutinarias de laboratorio, diagnóstico y terapia de PDAC. Asimismo, el papel de ABCC3 no está determinado, probablemente debido a la falta de anticuerpos específicos en la detección de la proteína ABCC3. Por ello, la generación y validación de anticuerpos frente a ABCC3 podría impactar en la investigación contra el cáncer.
Por ello, generamos una librería de Nbs. Primero, inmunizamos dromedarios con células que sobreexpresan ABCC3. Después de la inmunización, obtuvimos las regiones VHH producidas por los dromedarios y generamos un método de selección de Nbs en E. coli con una complejidad de 108 clones. Para identificar y seleccionar los Nbs que reconocen ABCC3 usamos dos métodos de selección diferentes: selección en superficie celular y ¿cell sorting¿.
Finalmente, identificamos dos Nbs que fueron validados para la detección de ABCC3 in vitro e in vivo de PDAC utilizando modelos preclínicos y muestras derivadas de pacientes. Estos Nbs no resultaron tóxicos en modelos de ratón y podrían ser eficientes como sondas moleculares para su uso en el diagnóstico de PDAC mediante inmuno-PET. Además de su potencial como herramientas de diagnóstico, los Nbs se testaron como herramientas terapéuticas. Así los Nbs fueron capaces de disminuir la proliferación en células que expresan ABCC3 y redujeron la resistencia a gemcitabina en células de PDAC.
Los resultados de este trabajo sugieren ABCC3 como un posible biomarcador de tumores de PDAC, dando información sobre su respuesta a tratamientos. Hemos demostrado que ABCC3 se expresa en las CSCs y que contribuye a mantener su metabolismo mitocondrial mediante su participación en el transporte de GSH. Finalmente, mediante la selección de Nbs por ¿cell sorting¿, se generaron dos Nbs que reconocen ABCC3 in vitro e in vivo y que pueden ser usados como herramientas de diagnóstico, incluido el inmuno-PET. Estos Nbs podrían tener también potencial terapéutico al reducir la proliferación y resistencia a gemcitabina en células que expresan ABCC3.
En resumen, nuestros resultados sugieren ABCC3 como un posible biomarcador de tumores de PDAC que podría dar información acerca del pronóstico y respuesta a tratamiento. Además, hemos generado Nbs que podrían ser utilizados en el diagnóstico y el tratamiento de pacientes de PDAC.
Resumen (otro idioma):
Los transportadores ATP-binding cassete (ABC) constituyen una de las familias más amplias de proteínas transmembrana, están implicados en el movimiento de diferentes xenobióticos, compuestos, lípidos y productos metabólicos entre el citoplasma y el espacio extracelular6. Especialmente, la subfamilia ABCC, también conocida como proteína de resistencia a compuestos (MRP), aborda el mayor número de proteínas implicadas en el transporte de compuestos. Los transportadores ABC, y más específicamente las proteínas MRP, se han encontrado sobreexpresados en diversos tipos de cáncer, y han sido propuestos como biomarcadores de los mismos7. Incluso, estos transportadores han sido relacionados con la resistencia a agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de pacientes de PDAC8. ABCC3 ha sido recientemente mostrado como una de las proteínas sobreexpresadas en PDAC, y ha sido relacionada con un incremento de la proliferación de células y tumores9. Nuestros estudios han consistido en profundizar en las funciones de ABCC3 en PDAC con un posible transportador de gemcitabina y su posible relación con la capacidad stemness de este tipo de cáncer.
Nuestra hipótesis era que ABCC3 está sobreexpresado en tumores PDAC y confiere resistencia a tratamientos con gemcitabina. Nuestro primer objetivo fue determinar la implicación de ABCC3 en proliferación y resistencia en PDAC. Corroboramos que la falta de ABCC3 reduce la proliferación in vitro e in vivo y que es uno de los responsables de la resistencia a gemcitabina en PDAC.
Uno de los principales retos en el abordaje del tratamiento de PDAC es la resistencia de las ¿cancer stem cells¿ (CSCs). Estas células constituyen una subpoblación de células con características de auto-regeneración, diferenciación, y habilidades que participan en el inicio, la progresión y la metástasis de tumores10. Las CSCs han sido caracterizadas por la expresión de proteínas que favorecen sus habilidades especiales, como la aldehído deshidrogenasa (ALDH) o los transportadores ABC, que contribuyen a su capacidad de auto-regeneración y quimioresistencia11.
ABCC3 se ha relacionado con ¿stemness¿ en otros tipos de cáncer, como cerebro o mama12,13. Una vez que demostramos la implicación de ABCC3 en quimioresistencia, quisimos investigar la relación del transportador ABCC3 y ¿stemness¿ en PDAC. Pudimos observar que las CSCs son la subpoblación que expresa ABCC3, y que esto podría estar relacionado, en parte, con su capacidad para ser resistentes a agentes quimioterapéuticos.
Las CSCs de PDAC se caracterizan por favorecer el metabolismo mitocondrial en lugar del glicolítico. Estas metabolismo oxidativo conlleva un incremento de las enzimas relacionadas con este metabolismo, y un incremento de niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS)14. El glutatión (GSH) es un conocido antioxidante en las células, y se ha descrito como sustrato de diferentes transportadores ABC, incluido ABCC315. Nuestra hipótesis fue que las CSCs podrían regular los niveles de ROS mediante la participación de ABCC3 en el transporte intracelular de GSH para mantener un equilibrio y evitar los altos niveles de ROS. Corroboramos que las CSCs utilizan la fosforilación oxidativa (OXPHOS) como la principal ruta de obtención de adenosín trifosfato (ATP). Es más, pudimos observar que ABCC3 es uno de los transportadores de GSH y que está implicado en rutas antioxidantes.
Los anticuerpos y fragmentos derivados de anticuerpos han sido utilizados para su uso en diagnóstico y terapia en diferentes enfermedades. Los nanoanticuerpos (Nbs) son derivados de la región de unión a antígeno de anticuerpos de cadena pesada (HcAbs) presentes en camélidos. Los Nbs conserva el potencial de unión a antígenos pero presentan un tamaño menor (12-15 kDa), lo que reduce su tiempo de vida medio en el torrente sanguíneo (0.5-1 h)16.
La inmuno-tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica de imagen que combina la especificidad de los Abs o fragmentos derivados de Abs con la selectividad del PET. Es una novedosa opción para mejorar el diagnóstico por imagen para una detección concisa y la cuantificación de la diana17. Nuestro segundo objetivo fue generar Nbs que reconocen ABCC3 para su uso en técnicas rutinarias de laboratorio, diagnóstico y terapia de PDAC. Asimismo, el papel de ABCC3 no está determinado, probablemente debido a la falta de anticuerpos específicos en la detección de la proteína ABCC3. Por ello, la generación y validación de anticuerpos frente a ABCC3 podría impactar en la investigación contra el cáncer.
Por ello, generamos una librería de Nbs. Primero, inmunizamos dromedarios con células que sobreexpresan ABCC3. Después de la inmunización, obtuvimos las regiones VHH producidas por los dromedarios y generamos un método de selección de Nbs en E. coli con una complejidad de 108 clones. Para identificar y seleccionar los Nbs que reconocen ABCC3 usamos dos métodos de selección diferentes: selección en superficie celular y ¿cell sorting¿.
Finalmente, identificamos dos Nbs que fueron validados para la detección de ABCC3 in vitro e in vivo de PDAC utilizando modelos preclínicos y muestras derivadas de pacientes. Estos Nbs no resultaron tóxicos en modelos de ratón y podrían ser eficientes como sondas moleculares para su uso en el diagnóstico de PDAC mediante inmuno-PET. Además de su potencial como herramientas de diagnóstico, los Nbs se testaron como herramientas terapéuticas. Así los Nbs fueron capaces de disminuir la proliferación en células que expresan ABCC3 y redujeron la resistencia a gemcitabina en células de PDAC.
Los resultados de este trabajo sugieren ABCC3 como un posible biomarcador de tumores de PDAC, dando información sobre su respuesta a tratamientos. Hemos demostrado que ABCC3 se expresa en las CSCs y que contribuye a mantener su metabolismo mitocondrial mediante su participación en el transporte de GSH. Finalmente, mediante la selección de Nbs por ¿cell sorting¿, se generaron dos Nbs que reconocen ABCC3 in vitro e in vivo y que pueden ser usados como herramientas de diagnóstico, incluido el inmuno-PET. Estos Nbs podrían tener también potencial terapéutico al reducir la proliferación y resistencia a gemcitabina en células que expresan ABCC3.
En resumen, nuestros resultados sugieren ABCC3 como un posible biomarcador de tumores de PDAC que podría dar información acerca del pronóstico y respuesta a tratamiento. Además, hemos generado Nbs que podrían ser utilizados en el diagnóstico y el tratamiento de pacientes de PDAC.
Resumen (otro idioma):
Pal. clave: diagnóstico por imagen
Titulación: Programa de Doctorado en Bioquímica y Biología Molecular
Plan(es): Plan 485
Área de conocimiento: Ciencias
Nota: Presentado: 28 02 2022
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, , 2022
-
Todos los derechos reservados
Enlace permanente:
Visitas y descargas
Registro creado el 2024-04-22, última modificación el 2024-04-22
