The action mechanism of prokaryotic FAD synthetases as a potential drug target for the treatment of bacterial infections

Sebastián Valverde, María
MEDINA TRULLENQUE, MILAGROS (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2018
(Bioquímica y Biología Molecular y Celular)


Resumen: Las FAD sintetasas bacterianas (FADS) son enzimas bifuncionales y bimodulares cuya función es producir los cofactores esenciales FMN y FAD a partir de Riboflavina (RF o vitamina B2). Estas proteínas se organizan en dos módulos casi independientes, cada uno de los cuales lleva a cabo una de las actividades mediante las cuales se sintetizan FMN y FAD. El módulo C-terminal transforma RF en FMN mediante una actividad riboflavin quinasa, mientras que el módulo N-terminal cataliza la actividad FMN:adenililtransferasa que transforma el FMN en FAD. Debido al carácter esencial de los cofactores FMN y FAD y a las diferencias entre FADSs bacterianas y las correspondientes enzimas de mamíferos (sobre todo entre el módulo FMNAT de las enzimas bacterianas y las enzimas que transforman FMN en FAD en mamíferos), estas enzimas son potenciales dianas terapéuticas. Por este motivo, merece la pena profundizar en el estudio de las FADs bacterianas, en la comprensión de sus ciclos catalíticos y de sus estrategias regulatorias, centrándonos en las diferencias entre diferentes miembros de esta familia.
Por lo tanto, durante el desarrollo de la presente tesis doctoral hemos abordado los
siguientes proyectos:
- Estudio de los determinantes estructurales que modulan el equilibrio de oligomerización de la FADS del organismo Corynebacterium ammoniagenes (CaFADS). CaFADS estabiliza durante sus ciclos catalíticos distintos ensamblados oligoméricos, siendo especialmente relevante la formación de un hexámero compuesto por un dímero de trímeros. En esta estructura los protómeros adoptan unadisposición cabeza-cola, lo que sugiere que el dímero de trímeros podría tener un papel activo en la canalización del FMN desde el sitio RFK hasta el sitio FMNAT, donde será transformado en FAD. Para validar esta hipótesis, producimos y caracterizamos mutantes puntuales localizados en la interfase entre protómeros. Aparentemente, los residuos mutados estabilizaban el dímero de trímeros mediante la formación de puentes salinos, interacciones de Van der Waals o interacciones hidrófobas con residuos localizados en el módulo opuesto del protómero adyacente en cada trímero. Nuestros resultados revelaron que todas las variantes eran activas y capaces de estabilizar estructuras cuaternarias, aunque la mayoría de ellas muestran alteradas sus actividades RFK y FMNAT, así como los parámetros de interacción con los ligandos y la tendencia a la oligomerización. Mención especial requiere el hecho de que mutaciones localizadas en el módulo RFK modulaban la actividad FMNAT y viceversa. Estos resultados sólo pueden explicarse en el marco del dímero de trímeros, en el que residuos de diferentes módulos están en estrecho contacto. Estos resultados validan la hipótesis de la formación de estructuras oligoméricas, en las que los protómeros adoptan una disposición cabeza-cola, durante los ciclos catalíticos de CaFADS. Además, nuestros estudios permiten determinar el papel de residuos concretos en las actividades RFK y FMNAT de esta enzima.
- Estudio comparativo de los ciclos catalíticos RFK y FMNAT de las FADSs de los organismos C. ammoniagenes y Streptococcus pneumoniae (CaFADS y SpnFADS, respectivamente). A pesar de las similitudes generales entre FADSs bacterianas, enzimas de diferentes organismos muestran importantes diferencias funcionales. El estudio de estas disparidades puede proporcionar las herramientas adecuadas para el diseño de compuestos selectivos de especie, que sean capaces de neutralizar un organismo específico mediante la inhibición selectiva de su FADS, sin afectar la flora del huésped. Este es el caso de CaFADS y SpnFADS, que muestran gran homología estructural pero importantes diferencias en sus actividades. En este proyecto hemos llevado a cabo una primera caracterización funcional de SpnFADS, identificando tres importantes diferencias respecto a CaFADS. De este modo y contrariamente a CaFADS, SpnFADS i) no estabiliza el dímero de trímeros, ii) su actividad FMNAT requiere condiciones reductoras fuertes, y iii) la actividad RFK de SpnFADS no muestra inhibición por el sustrato RF. Asimismo, un estudio más detallado de la actividad RFK de ambas enzimas nos permitió identificar los determinantes cinéticos y termodinámicos responsables de las citadas diferencias. La integración de nuestros datos experimentales y su interpretación en el marco de las estructuras cristalográficas disponibles, ha arrojado luz sobre las diferentes estrategias reguladoras adoptadas por estas dos enzimas.
- Desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos contra FADSs bifuncionales. Debido a la irrupción durante las últimas décadas de cepas bacterianas resistentes a antibióticos, la necesidad de nuevas dianas terapéuticas antibacterianas, así como de fármacos dirigidos contra ellas ha quedado manifiesta. De este modo, y debido a su carácter esencial, junto a otras características deseables, proponemos a las FADS procariotas como dianas terapéuticas explotables durante el proceso de búsqueda de nuevos antibióticos. En este proyecto hemos optimizado un protocolo para la identificación de potenciales inhibidores de estas enzimas, utilizando como modelo CaFADS. Posteriormente hemos utilizado esta metodología para identificar compuestos que podrían ser utilizados como drogas de amplio espectro o selectivas de especie. Nuestro protocolo comienza con la identificación de potenciales inhibidores mediante un cribado de alto rendimiento, basado en las actividades enzimáticas de la proteína y la consiguiente identificación de la actividad inhibida. Los mejores inhibidores de la actividad FMNAT (ya que es más probable que estos compuestos no afecten a las enzimas de mamíferos) fueron estudiados más detalladamente y sus mecanismos de inhibición determinados. Paralelamente, se comprobó el efecto bacteriostático de los compuestos identificados mediante el cribado en diferentes cepas bacterianas. En este proyecto hemos identificado compuestos prometedores que podrían usarse como inhibidores selectivos de la FADS de un organismo en concreto, y otros que podrían desarrollarse como fármacos de amplio espectro.


Resumen (otro idioma): 

Pal. clave: bioquimica

Departamento: Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Nota: Presentado: 12 01 2018
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Bioquímica y Biología Molecular y Celular, 2018

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 Registro creado el 2019-01-22, última modificación el 2019-01-22


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