Caracterización molecular y celular de la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados en plantas y su relación con la producción de oxilipinas

Lagunas Castán, Beatriz
Alfonso Lozano, Miguel (dir.)

Universidad de Zaragoza, 2013
(Bioquímica y Biología Molecular y Celular)


ISBN: 2013-


Abstract: Introducción/motivación: Los aceites de origen vegetal se han convertido en elementos clave para el desarrollo de los sectores agro-biotecnológico e industrial. Su producción está en auge, ya que se ha triplicado en los últimos 20 años y se espera que se duplique desde ahora a 2030 (Chapman y Ohlrogge, 2012). Los aceites vegetales se producen principalmente para la alimentación humana (aceites y margarinas), pero ha aumentado su uso en la industria química para la síntesis de multitud de productos (biodiesel, pinturas, lubricantes, cosméticos, detergentes, plásticos, resinas...). Estos nuevos objetivos se marcan como consecuencia del encarecimiento del precio del petróleo, la concienciación sobre el impacto del uso de combustibles fósiles y la necesidad de desarrollar fuentes renovables de combustible y material industrial (Somerville, 2007 ; Dyer y col., 2008). En una gran mayoría de casos, el valor industrial de estos aceites está limitado por su composición de ácidos grasos. Debido a esto, la manipulación del contenido en ácidos grasos de especies vegetales se vuelve un tema de interés creciente a nivel mundial. Sin embargo, cualquier avance biotecnológico en cualquiera de estos campos requiere del conocimiento básico de las rutas de síntesis y almacenamiento de los ácidos grasos, lípidos y fitohormonas derivadas de los mismos así como su respuesta a diferentes estreses y factores ambientales (Somerville y Browse, 1991 ; Somerville y Bonetta, 2001). En numerosas ocasiones, los intentos de modificar las rutas de biosíntesis de ácidos grasos en plantas se ven frustrados por la complejidad de las reacciones que intervienen en las mismas, identificando ¿cuellos de botella¿ que dificultan el desarrollo del producto final con valor añadido. El estudio de estos ¿cuellos de botella¿ se ve dificultado por varias razones. En primer lugar, muchos de los enzimas que intervienen en la biosíntesis de lípidos y/o ácidos grasos son proteínas de membrana, lo que dificulta su caracterización bioquímica (purificación, determinación de parámetros enzimáticos, etc.). En una gran mayoría de casos, aspectos básicos tales como el número de genes que codifican cada una de las proteínas que intervienen en estas rutas o su localización celular son totalmente desconocidos. Las membranas vegetales están compuestas principalmente por glicerolípidos y son las barreras naturales entre células y orgánulos subcelulares. Esta compartimentalización es vital para el funcionamiento celular global. A su vez, existen numerosas reacciones que se desarrollan en el interior de las membranas, como por ejemplo las que tienen lugar durante la fotosíntesis (captación de la luz solar y transferencia electrónica). Desde un punto de vista fisiológico, la existencia de las membranas biológicas permite la formación del gradiente de protones clave para el mantenimiento de la bioenergética celular (Peter, 1961; 1979), y determina los fenómenos de homeostasis iónica, de gran importancia a nivel celular. La regulación de la síntesis de ácidos grasos y glicerolípidos, y el mantenimiento de las propiedades de las membranas (fluidez, composición lipídica¿) es muy importante para el correcto funcionamiento celular. La diversidad de clases de lípidos y la conservación de su proporción en cada tipo de membrana a lo largo del reino vegetal hace pensar que éstas diferencias son importantes para la función de cada membrana (Ohlrogge y col., 1991 ; Moreau y col., 1998). La composición de ácidos grasos y lípidos de membrana de una planta es variable, y se ve afectada por factores como el desarrollo del tejido, la sequía, la salinidad o el frío. Además de éstos, la deficiencia de fosfato es uno de los condicionantes ambientales más comunes que también provoca variaciones en la composición de lípidos de membrana (Shimojima, 2011). El intercambio dinámico de lípidos entre membranas de una célula vegetal es un proceso natural e indispensable para el correcto desarrollo de la planta. Algunos estudios recientes han demostrado que sin el transporte de lípidos entre membranas la viabilidad de las semillas está impedida (Xu y col., 2005 ; Xu y col., 2008). Las desaturasas son las enzimas que introducen los dobles enlaces en la cadena alquílica de los ácidos grasos, produciendo ácidos grasos insaturados y poliinsaturados. A través de su actividad, las desaturasas controlan las propiedades fisico-quimicas de las membranas y, por tanto, parámetros fundamentales como su fluidez. Sin embargo, son enzimas muy poco caracterizados a nivel celular, bioquímico y estructural. La mejor caracterizada es la única desaturasa soluble (FAB2), que actúa sobre sustratos acil-ACP. Esta desaturasa ha sido purificada y se conoce incluso su estructura tridimensional (Lindqvist y col., 1996). Las demás desaturasas actúan sobre ácidos grasos esterificados al glicerol y son proteínas de membrana. Debido a esto, el estudio de sus características bioquímicas, su actividad, localización y purificación es extremadamente dificultoso. Gran parte del conocimiento sobre la actividad y localización de las desaturasas de membrana proviene del aislamiento de los mutantes de Arabidopsis en los años 80 y el aislamiento de los genes que las codifican en los 90 (Browse y col., 1991 ; Somerville y col., 2000 ; Wallis y Browse, 2002 ; Heilmann y col., 2004 ; Gao y col., 2009). Sólo recientemente se ha visto que, en algunas especies relevantes para la producción de aceites vegetales como la soja, existen varias copias para cada gen (Heppard y col., 1996 ; Andreu y col., 2010). Los datos relativos a su localización celular se derivan en su mayoría de trabajos de proteómica donde se han detectado principalmente en la envuelta interna del cloroplasto (Ferro y col., 2003). Sin embargo, existen muy pocos estudios que hayan abordado este problema utilizando herramientas celulares. Los ácidos grasos no sólo son componentes estructurales de los lípidos de membrana. En algunos casos, pueden ser precursores de compuestos con actividad hormonal. Así, las oxilipinas son moléculas derivadas de los ácidos grasos poliinsaturados. Algunas de las moléculas que componen ésta amplia familia se han relacionado con la regulación de procesos básicos del desarrollo vegetal desde hace tiempo (McConn y Browse, 1996). El miembro más conocido de esta familia es el ácido jasmónico (JA), que se sintetiza desde los ácidos grasos poliinsaturados 16:3 y 18:3 (Schaller y Stintzi, 2009). La síntesis de JA desde sus precursores conlleva la producción de moléculas intermediarias como dnOPDA (ácido dinor-oxo-fitodienoico, derivado del 16:3) u OPDA (ácido oxo-fitodienoico, derivado del 18:3). Hasta el momento, se ha descrito que la molécula OPDA tiene actividad hormonal per se en plantas de Arabidopsis (Taki y col., 2005). Sin embargo, poco se conoce de la acción hormonal del dnOPDA, ya sea ésta individual o en combinación con otras hormonas vegetales. Desarrollo teórico: 1.- Regulación de la expresión de las omega-3 desaturasas durante el desarrollo de la hoja en soja. 1.1. Efecto del desarrollo de la hoja sobre la expresión y actividad de las omega-3 desaturasas de soja (Glycine max cv. Volania). En primer lugar, se procedió al crecimiento de plantas de soja (Glycine max cv. Volania) en cámara bioclimática bajo condiciones de luz, temperatura y humedad controladas. Se tomaron muestras de hojas trifoliares en diferentes estadios de desarrollo correspondientes a hojas recién abiertas (RA) y tras 3, 7, 14 y 18 días de desarrollo. Sobre estas hojas se realizaron dos tipos de determinaciones. En primer lugar se procedió a la extracción de lípidos totales y determinación de la composición de ácidos grasos mediante el análisis de los ésteres metílicos mediante cromatografía de gases (GC). En paralelo se llevó a cabo un análisis de la expresión de los genes de las omega-3 desaturasas de soja. Para ello se extrajo el RNA total de hojas para cada etapa del desarrollo estudiada y se procedió a la síntesis de cDNA y posterior análisis de expresión mediante RT-PCR semicuantitativa, utilizando pares de cebadores específicos para cada gen. Esto nos permitió establecer una correlación entre los cambios en la composición de ácidos grasos durante el desarrollo de la hoja y los cambios en la expresión de los genes de las omega-3 desaturasas. De este modo establecimos la existencia de mecanismos de regulación de la expresión de los genes que codifican las omega-3 desaturasas durante el desarrollo de la hoja, las diferencias entre isoformas de cada una de las familias génicas que codifican estos enzimas y diferencias en su expresión relacionadas con la diferente localización (reticular o plastidial) de estos enzimas. 1.2.- Expresión y actividad de las omega-3 desaturasas en cultivos celulares fotosintéticos de soja. Se utilizaron cultivos celulares fotosintéticos de soja como herramienta para contrastar los resultados obtenidos durante el desarrollo de la hoja en plantas de soja. Estas suspensiones celulares fotosintéticas se comportan desde un punto de vista fisiológico de manera similar a las hojas de mesófilo jóvenes. De igual modo, su composición lipídica y de ácidos grasos es similar a la de las hojas jóvenes. Se realizaron determinaciones de la composición de ácidos grasos y de la expresión de los genes de las omega-3 desaturasas de soja durante un ciclo de cultivo (0, 7, 14 y 21 días). Se establecieron semejanzas en el comportamiento de las suspensiones celulares y las hojas de soja, especialmente con las más jóvenes. 1.3.- Análisis in silico de las regiones promotoras de los genes de las omega-3 desaturasas en soja. Una vez obtenidos los perfiles de acumulación de ácidos grasos y de expresión de los genes que codifican las omega-3 desaturasas de soja, se procedió a analizar las secuencias de los promotores de cada uno de los genes que codifican estos enzimas con objeto de identificar posibles elementos reguladores (factores de transcripción) responsables de los perfiles de expresión obtenidos en el análisis de expresión génica. Se utilizaron para ello dos plataformas accesibles en Internet, PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) y PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) que permiten la identificación de secuencias diana de factores de transcripción y elementos reguladores en secuencias genómicas. 1.4.- Comparativa de los datos con otras plantas de metabolismo lipídico o patrón de desarrollo diferente. Aunque los cambios en la composición de ácidos grasos durante el desarrollo foliar han sido analizados en gran variedad de especies vegetales, muy pocos estudios han analizado esta cuestión a nivel molecular. De este modo tomamos ventaja de los datos obtenidos en nuestro estudio en soja comparándolos con otros resultados disponibles para otras especies vegetales tales como Arabidopsis o trigo. Dado el diferente patrón de desarrollo embrionario (el trigo es una especie monocotiledónea mientras que soja y Arabidopsis son especies dicotiledóneas) o las diferencias en la ruta principal de síntesis de glicerolípidos (Arabidopsis es una planta 16:3, mientras que soja y trigo son 18:3), este estudio comparado nos permitió establecer elementos comunes y diferenciales en la regulación de las omega-3 desaturasas durante el desarrollo de la hoja en función de estos dos parámetros. 2.- Localización, organización y regulación de las omega-6 y omega-3 desaturasas plastidiales. En este objetivo pretendimos analizar la localización celular y distribución de la omega-6 desaturasa FAD6 y la omega-3 desaturasa FAD7. Para ello se utilizaron dos estrategias complementarias. 2.1.- Identificación de la proteína GmFAD7 mediante anticuerpos específicos. Distribución en tejidos y fracciones subcelulares. En este sub-objetivo pretendimos analizar la distribución de la proteína GmFAD7 en diferentes tejidos (raíces, tallos, hojas, flores, semillas) de plantas de soja así como en diferentes fracciones subcelulares, con especial interés en las fracciones sub-cloroplásticas (envueltas, estroma, tilacoides). Para ello, una primera tarea consistió en la puesta a punto de protocolos de aislamiento de fracciones celulares y subcelulares a partir de los diferentes tejidos de interés. Para ello se utilizaron básicamente técnicas de centrifugación y ultra-centrifugación en gradientes de sacarosa y/o percoll que permiten el aislamiento de este tipo de fracciones. Posteriormente, se determinó la validez del anticuerpo antiGmFAD7, obtenido en nuestro laboratorio a partir de un péptido sintético conteniendo una región de la proteína GmFAD7 específica de esta omega-3 desaturasa. Para tal efecto se realizaron los ensayos correspondientes tanto con el suero preinmune como de inmunodepleción utilizando el péptido sintético con objeto de evaluar la respuesta del anticuerpo. Dado que las respuestas fueron negativas decidimos abordar la cuestión desde otra tecnología, la generación de líneas estables de Arabidopsis que expresaran las fusiones de las proteínas. 2.2.- Obtención de líneas transgénicas de Arabidopsis expresando fusiones AtFAD6:CFP y AtFAD7:YFP. Localización subcelular utilizando microscopía confocal. Como alternativa al estudio bioquímico utilizando anticuerpos específicos contra la proteína GmFAD7 de soja, pretendimos abordar el estudio de la distribución subcelular de las omega-3 y omega-6 desaturasas de plantas a través de la obtención de líneas transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresen las fusiones AtFAD6:CFP y AtFAD7:YFP. Estas líneas transgénicas se obtuvieron utilizando la tecnología Gateway en vectores del tipo pEarleyGate (Earley y col., 2006). Los genes reporteros se colocaron en el extremo C-terminal con objeto de evitar problemas relacionados con el procesamiento del péptido señal en el extremo N-terminal. Se transformaron plantas de fenotipo silvestre (ecotipo Col-0) y se seleccionaron los transformantes en presencia del herbicida fosfinotricina, que es el marcador molecular utilizado por los vectores seleccionados para este estudio. Una vez seleccionados los individuos transformantes, se segregó el evento transgénico obteniendo líneas homocigotas T3. Una vez obtenidas estas líneas estables se procedió a determinar mediante microscopía confocal la localización subcelular de AtFAD6 y AtFAD7. Los resultados obtenidos en el microscopio confocal se contrastaron utilizando anticuerpos específicos contra GFP, que reconocen tanto YFP como CFP. La consecución global de estos objetivos proporcionó nuevos datos relevantes acerca de la localización y organización subcelular de estos enzimas y abre la posibilidad de estudiar su posible interacción en la membrana. 3.- El ácido graso hexadecatrienoico como precursor de la síntesis de jasmonatos. En este sub-objetivo pretendimos evaluar el posible papel hormonal del dnOPDA. Esta molécula se deriva del ácido graso 16:3 y actúa como precursor de la síntesis de ácido jasmónico (JA). Para abordar este sub-objetivo pretendimos tomar ventaja de una colección de mutantes de Arabidopsis deficientes en la instauración de ácidos grasos; más concretamente el triple mutante fad3/fad7/fad8, que no sintetiza ningún ácido graso trienoico y por tanto no es capaz de sintetizar ningún miembro de la familia de los jasmonatos y el mutante fad5, que no sintetiza 16:3 pero acumula 18:3 en cantidades similares al individuo de fenotipo silvestre. Este defecto provoca que no sintetice dnOPDA, pero si OPDA y JA. En primer lugar, procedimos al análisis de datos transcriptómicos obtenidos de ambos mutantes crecidos en condiciones normales de cultivo. Se filtraron aquellos genes con expresión diferencial en cada uno de los mutantes y se determinaron cuáles de estos genes son comunes a ambas líneas vegetales. Una vez identificados estos genes y una vez validada su respuesta en la micromatriz mediante RT-PCR semicuantitativa, se realizó en primer lugar un análisis de categorías funcionales con objeto de determinar su función y clasificación. Se prestó especial atención a aquellos genes relacionados con respuestas de defensa, estrés biótico y señalización hormonal, más susceptibles de ser dianas de dnOPDA. También se compararon los genes identificados en el análisis transcriptómico con datos procedentes de estudios transcriptómicos similares obtenidos tras la suplementación de plantas silvestres de Arabidopsis con JA y OPDA (Taki y col., 2005). Todos estos análisis ayudaron a elaborar un listado de genes potencialmente regulados por dnOPDA. Una vez elaborado este listado de genes potencialmente sensibles a dnOPDA realizamos experimentos de suplementación con dnOPDA (proporcionado por el Dr. Mats Hamberg, Karolinska Institut, Estocolmo, Suecia) con objeto de confirmar su respuesta a la hormona. Estos experimentos se llevaron a cabo en líneas silvestres (col-0) y triple mutante fad3/fad7/fad8 con objeto de evaluar la presencia o ausencia de otros jasmonatos. Se compararó la respuesta de estos genes al JA con objeto de determinar las posibles sinergias o antagonismos existentes entre dnOPDA y JA. Conclusiones: 1. El desarrollo de las hojas en plantas de soja (Glycine max) va acompañado de un aumento de la cantidad de ácido graso linolénico (18:3). Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral sugieren la existencia de un mecanismo de control de la expresión de los genes que codifican las diferentes omega-3 desaturasas, tanto reticulares como plastidiales, basado en una regulación temporal. Así, parece que las principales responsables de la producción de 18:3 en las primeras etapas de desarrollo de las hojas serían las omega-3 desaturasas reticulares (GmFAD3A y GmFAD3B), mientras que en hojas maduras serían las desaturasas plastidiales. 2. El análisis comparado de los perfiles de expresión en soja, con los de otras especies vegetales como Arabidopsis o trigo, sugiere la existencia de diferencias en el mecanismo que controla la diferente contribución de las omega-3 desaturasas plastidiales y reticulares a la producción de ácidos grasos trienóicos durante el desarrollo de la hoja. Estas especies difieren tanto en su patrón de diferenciación embrionario (dicotiledóneas como soja o Arabidosis y monocotiledóneas como el trigo) como en la contribución de las rutas de biosíntesis de glicerolípidos y desaturación de ácidos grasos (plantas 18:3 como soja o trigo frente a Arabidopsis que es una especie 16:3).. 3. Todas las omega-3 desaturasas de soja se expresan durante la germinación de las semillas, contrastando con el bajo nivel de ácido graso 18:3 en este tejido (alrededor de un 20 %). Estos resultados sugieren la existencia de un mecanismo de regulación post-transcripcional que controlaría de manera exhaustiva la actividad de estos enzimas en este tejido. 4. El análisis mediante microscopía confocal de líneas transgénicas de Arabidopsis que sobre-expresan las fusiones AtFAD6:CFP y AtFAD7:YFP, confirmó la localización cloroplástica de estas proteínas. Este mismo análisis mostró que la localización de estas proteínas en la envuelta cloroplástica se restringió a zonas concretas de esta membrana, lo que proporcionó una primera evidencia de la posible organización de las desaturasas FAD6 y FAD7 en la membrana. Esta organización sugirió la existencia de áreas de la membrana especializadas en la desaturación de ácidos grasos.. 5. Tanto los datos obtenidos mediante microscopía confocal correspondientes a diferentes edades de la planta, como el análisis por western blot con anticuerpos anti-GFP de la acumulación de las proteínas durante el desarrollo de las hojas en las líneas transgénicas, mostró una mayor acumulación de AtFAD6 y AtFAD7 en cloroplastos pequeños de hojas jóvenes. Esto sugiere la existencia de un patrón de acumulación de la proteína dependiente del estadio de desarrollo de los cloroplastos en la hoja y apunta hacia un papel más relevante de estas proteínas al comienzo del desarrollo de la hoja en Arabidopsis. 6. El análisis transcriptómico de los mutantes fad5 y fad3/fad7/fad8 mostró, en cada mutante, un elevado número de genes con expresión diferencial relacionados con el estrés biótico, las respuestas de defensa frente a patógenos y la biosíntesis o señalización de hormonas de la familia del jasmónico. La presencia de este tipo de genes en ambos mutantes; cuyo defecto común es la síntesis de 16:3 y la oxilipina derivada de éste, el dnOPDA, se relacionó con una ruta de regulación dependiente de dnOPDA. 7. La suplementación de plantas silvestres (Col-0) y de plantas de los mutantes fad3/fad7/fad8 y aos (que no sintetizan ni jasmónico ni sus intermediarios, OPDA y dnOPDA) con dnOPDA mostró la existencia de genes que variaban su expresión en respuesta al dnOPDA. Entre ellos se encuentran los genes At2g39330 (JAL23), At3g45140 (LOX2), At1g17420 (LOX3), At2g06050 (OPR3) o At1g32640 (MYC2), todos ellos relacionados bien con la biosíntesis de jasmónico o bien con su señalización. Estos resultados sugerirían un efecto similar entre el dnOPDA y el jasmónico. 8. La suplementación con dnOPDA mostró la existencia de un segundo grupo de genes con expresión diferente entre los mutantes y la línea silvestre, confirmando por tanto el análisis transcriptómico, pero que no variaban su expresión en respuesta al dnOPDA. La presencia de genes regulados por jasmonato (JRGs) entre estos genes, indica que los resultados observados se deben a una respuesta específica del dnOPDA y no a una posible conversión del dnOPDA en JA. 9. Es difícil establecer un posible papel biológico específico del dnOPDA. La caracterización fenotípica de los mutantes apunta al control de la elongación de la raíz como uno de los posibles papeles biológicos de esta molécula, de un modo similar al descrito para el jasmónico. Del mismo modo, la presencia entre los genes con expresión diferencial en ambos mutantes de genes de respuesta a herida o de defensa frente a patógenos sugieren que el dnOPDA podría estar implicado en el control de estos procesos.

Pal. clave: biología de plantas ; biología molecular ; ciencias agrarias ; aceites vegetales

Knowledge area: Bioquímica y biología molecular

Department: Bioquímica y Biología Molecular y Celular

Nota: Presentado: 14 06 2013
Nota: Tesis-Univ. Zaragoza, Bioquímica y Biología Molecular y Celular, 2013

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 Record created 2014-11-20, last modified 2019-02-19


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